1.1 荧光探针技术的优点

　　荧光探针技术可有很多分类方法：例如，按照荧光探针物质本身的性质可以分为有机荧光探针，高分子荧光探针，量子点荧光探针等。荧光分析法具有灵敏度高、选择性好、方法简便、快速准确、线性范围宽等优点^.因此，与一般的分析方法相比，荧光分析法在定量分析中具有明显的优势。它通常分为两大类，一是直接测定法；二是间接测定法。直接测定法是利用物质本身发射的荧光来进行测定的分析方法。由于不少物质本身不发荧光或者发射荧光较弱，不能进行直接的荧光测定，从而妨碍了直接测定法的应用范围。间接测定法是利用特定的方法将某些荧光较弱或本身不发荧光的物质转变为发荧光的物质再进行测定的方法，也可以称为“荧光探针”技术。荧光探针的使用极大地扩大了荧光分析法的应用领域。

　　1.2还原型谷胱甘肽

　　还原型谷胱甘肽存在生物体中，基本上分布在生物的所有器官，是含量最丰富的硫醇分子。GSH由半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸组成的三肽分子，在正常情况下，GSH的水平异常直接会导致癌症、心脏病、衰老、以及其他的疾病。在许多生命活动中，GSH起着直接或者间接的作用包括基因表达调控、酶活性、代谢调节、对细胞的保护、氨基酸转运和免疫功能调节等。

　　1.3检测还原型谷胱甘肽的探针

　　Shao^[1]等合成了一种专一测定GSH的双螺吡喃探针，在水溶液中，该探针与谷胱甘肽反应的结合常数为K=(7.52±1.83)×10⁴ M^-1，该探针的优点是，能专一测定GSH，并不受其他多肽类和氨基酸的干扰。因此，该探针可以用于检测细胞内GSH的含量。其检测的主要原理是，在中性溶液中，该分子的识别功能是以螺吡喃开放的部花菁形式与分析物之间的静电作用力及结构互补性为基础，在体系中加入GSH后，部花菁形式打开，反应体系的荧光强度发生改变，在发射波长500 nm处，随着谷胱甘肽浓度增加，荧光强度不断降低，相反，在发射波长643 nm处，荧光强度不断升高。该探针已经成功用于在人T细胞中GSH的荧光成像分析。

　　Li^[2]等在金纳米粒子的基础上合成一种专一检测GSH的比色探针。在空白溶液中，加入双二硫代甲基甲酸哌嗪钠，形成金纳米聚合物，反应体系颜色由红色变为蓝色，从立体结构上分析，GSH含有多个突出的基团(–SH, –NH₂ 和 –COOH)，相对于双二硫代甲基甲酸哌嗪钠而言，GSH与金纳米粒子之间吸引力更强，可以在反应中作为一种抗聚合试剂。所以，金纳米聚合物与GSH反应以后，金纳米粒子聚合物进而“解体”呈现分散状态，体系颜色由蓝色变为紫色最后变成酒红色，而其他氨基酸不干扰其测定。

　　Ma^[3]等以Fe₃O₄纳米粒子为基础，利用比色法专一检测GSH。该报道中介绍，Fe₃O₄作为一种过氧化酶的模拟物，在反应中起到催化作用。首先，通过加入催化底物2,2-偶氮-双(3-苯并-二氢噻唑-6-磺酸)(ATBS)二胺盐和双氧水通过共沉淀方法制备Fe₃O₄纳米粒子，在实验体系中，加入GSH，消耗双氧水，引起整个体系颜色发生改变，裸眼可以观察到此实验现象。此方法检测GSH的线性范围为3.0-30.0 μΜ。回收率为96.7-107%，其他硫醇类氨基酸并不干扰其测定，该方法已经成功用于A549细胞中GSH的检测。

　　Niu^[4]等合成了一种以氟化硼络合二吡咯(BODIPY为母体的比率型荧光探针，该探针与硫醇类物质发生亲核取代反应，导致体系荧光波长红移，Cys或者Hcy侧链上的氨基能进一步取代硫醇的S原子，而形成氨基取代的BODIPY，荧光波长蓝移。然而，GSH只能发生亲核取代，不能进一步取代硫醇的S原子，体系荧光波长不会蓝移。所以，很容易将GSH从Cys或者Hcy中区分出来。在温度为37℃，乙腈/缓冲液(5:95v/v)的条件下，探针和GSH反应的荧光比率为I₅₈₈/I₅₅₆，在588 nm处，随着GSH浓度的增加，体系的荧光强度不断增强，相反在556 nm处，荧光强度不断降低。在加入其它氨基酸包括与其结构相似的Cys和Hcy后，都不干扰探针与GSH的反应。)

　　以上是检测GSH的荧光技术的几种研究成果，目前多数科研工作者参考此类方法进行GSH的检测。

　　参考文献

　　[1]Shao N., Jin J. Y., Wang H., et al. Design of bis-spiropyran ligands as dipolar molecule receptors and application to in vivo glutathione fluorescent probes[J]. Journal of the American Chemical Society, 2010, 132: 725-736

　　[2]Li Y., Wu P., Xu H.. Anti-aggregation of gold nanoparticle-based colorimetric sensor for glutathione with excellent selectivity and sensitivity[J]. Analyst, 2011, 136: 196-200

　　[3]Ma Y. H., Zhang Z. Y., Ren C. L., et al. A novel colorimetric determination of reduced glutathione in A549 cells based on Fe₃O₄ magnetic nanoparticles as peroxidase mimetics[J]. Analyst, 2012, 137: 485-489

　　[4]Niu L. Y., Guan Y. S., Chen Y. Z., et al. BODIPY-based ratiometric fluorescent sensor for highly selective detection of glutathione over cysteine and homocysteine[J]. Journal of the American Chemical Society, 2012, 134: 18928-18931

化工教研组：董维华